色谱,,40(2):-
DOI:10./SP.J.1..
郭民康,张健*
基于超高效液相色谱-串联质谱的股骨头坏死组织外泌体脂质代谢组学分析股骨头坏死(ONFH)是一种可导致股骨头塌陷进而需要接受全髋关节置换的疾病。该病严重影响患者的日常生活,给社会造成了重大的经济负担,但其发生机制和病理生理仍不清楚。Bartolmas等证实甘油磷脂在调节生理病理过程中发挥着重要作用。溶血磷脂酸(LPA)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)可促进内皮细胞迁移和血管生成。在小鼠去卵巢骨质疏松模型中,脂质代谢紊乱与骨吸收和骨形成的失衡密切相关。同时,许多研究认为脂质代谢紊乱为ONFH的代谢特征之一。
外泌体是一种直径为30~nm的细胞外囊泡,被双层脂膜包裹,其分泌由细胞高度调控。外泌体作为一种细胞间交流的方式,在一系列生理和病理过程中起着至关重要的作用。外泌体可以在受体细胞中产生生物反应,并转运小分子代谢物。
据报道,骨髓来源的间充质干细胞分泌的外泌体参与血管生成,调节骨代谢。前期研究表明,来自正常股骨头组织的外泌体可减少糖皮质激素诱导的大鼠模型ONFH的发生,促进间充质干细胞的成骨分化和迁移;基于蛋白质组学分析,血小板表面糖蛋白(CD41)缺陷的外泌体可导致ONFH的发生,但来自正常骨骼的外泌体可以改善ONFH的进展,然而其机制尚不清楚,因为外泌体包含代谢产物等分子。
因此,进一步研究来自ONFH骨组织外泌体中代谢物的作用是必要的,这可能为外泌体介导的代谢途径提供思路,加深我们对ONFH的理解。
代谢组学是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有相对分子质量较低代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。代谢物是细胞功能的组成部分,被认为拥有大量能预测表型的信息。超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术以其高精度和高灵敏度被广泛用于组学分析。
本研究基于UPLC-MS/MS的非靶向代谢组学技术分析了来源于ONFH骨组织外泌体内脂质代谢物的变化。本研究旨在为观察ONFH提供一个新的视角,并探索ONFH疾病外泌体中可能的代谢变化。
01样本收集所有实验均通过重庆医院伦理委员会的批准。本研究中的捐赠者均充分了解知情同意书的内容,同时也获得了每位捐赠者的书面知情同意。ONFH患者的纳入标准:(1)X射线、核磁共振(MRI)及病理表现与ONFH诊断一致;(2)根据国际骨循环研究会(ARCO)分期,患者处于Ⅲ~Ⅳ期;(3)患者未出现严重内源性疾病、畸形性骨炎、代谢性骨病、转移性骨癌、甲状旁腺功能亢进等疾病。本研究涉及30例ONFH患者及30例股骨颈骨折(FNF)患者的标本。患者的人口学统计数据见表1。
表1入组样本的临床信息(n=30)
02超速离心提取外泌体外泌体的分离纯化采用多级超速离心法进行。将mg股骨头组织充分研磨后与PBS混合,于4℃条件下以g离心10min,随后将上清液吸至另一高速离心管中,于4℃下以g离心30min,最后取上清液,于4℃下以0g离心70min,获得外泌体沉淀,使用PBS对外泌体进行重悬洗涤,以0g离心70min,获得纯净的外泌体沉淀。最后,用PBS吹打外泌体,用0.22μm滤器过滤,外泌体溶液的含量为1.9×particles/mL,保存于-80℃。
03蛋白免疫印迹分析向外泌体样本中加入RIPA裂解液,在冰上裂解20min后,以10r/min离心30min提取总蛋白质。BCA试剂盒测定总蛋白质浓度后进行蛋白免疫印迹分析,蛋白质上样量为每孔30μg。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离程序:以80V电压运行30min进行浓缩,以V电压运行60min进行分离。转膜程序:以mA电流运行90min,将蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上,在5%BSA中室温摇床封闭1h。将封闭好的PVDF膜先在双蒸水中清洗掉封闭液,然后放入洗膜缓冲液(TBST)中,摇床每次清洗7min,共3次。PVDF膜在4℃冰箱中与第一抗体孵育12h后,PVDF膜放入TBST,摇床每次清洗7min,共3次。最后,PVDF膜与第二抗体孵化1h。
04代谢物的提取外泌体按照之前的方案制备样品。具体实验步骤:以Hz超声持续5min破碎外泌体,然后加入μL乙腈,于4℃下以00r/min离心10min以去除微粒。取40μL上清液,用60μL蒸馏水稀释。将60μL上清液装入玻璃自动进样瓶中。每一组的剩余上清取10μL作为质控组。
05分析条件色谱条件
色谱柱:KinetexXB-C18色谱柱(mm×2.1mm,2.6μm);柱温:30℃;流动相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速:0.3mL/min,样品室温度:8℃。梯度洗脱程序:0~1.0min,10%B;1.0~8.0min,10%B~80%B;8.0~12.0min,80%B;12.0~15.0min,80%B~10%B。进样量:60μL。
质谱条件
质量扫描范围m/z:~0,鞘气压力为kPa,辅助气压力为kPa,气帘气压力为kPa,雾化温度为℃,采用飞行时间质谱全扫描-信息关联采集-子离子扫描(TOF-MSscan-IDA-productionscan)复合模式,TOF-MS一级预扫描和触发的二级扫描IDA离子累积时间分别为、ms,采用多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS)作为二级触发条件,解簇电压为±80V,碰撞能量叠加为(35±15)eV。
06数据分析将所得的原始数据通过MarkView软件转化后,进行峰识别、峰对齐、扣除溶剂峰、杂质峰、滤噪等处理,利用快捷峰视图(ShortcuttoPeakView)技术,通过化学智能峰匹配算法促进碎片离子分析过程,使用MMCD(